L-精氨酸（Arg）在多种代谢和生理过程中发挥重要作用，其浓度变化与病理过程密切相关。现有测量精氨酸的传统方法及现有基因编码的精氨酸荧光传感器存在局限性，亟需开发新型传感器。2025年1月21日，首都医科大学基础医学院饶毅课题组在ACS Sensors期刊发表题为“Development of a Genetically Encoded Sensor for Arginine”的最新研究成果。研究开发了一种新的Arg探针——ArgS1，能实时监测哺乳动物细胞中的精氨酸水平，有助于研究精氨酸代谢机制及相关生理病理作用。基础医学院博士研究生王纯为第一作者，昌平实验室咸逸副研究员与饶毅教授为并列通讯作者。
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MDA-MB-231细胞和ASS1过表达MDA-MB231细胞中ArgS1传感器的荧光强度和响应
01 研究结果
1、 ArgS传感器的设计与优化
大肠杆菌的artJ蛋白在结合精氨酸时会发生构象变化，基于这一特性，研究团队将来自GRABDA2m的环状置换绿色荧光蛋白（cpEGFP）嵌入artJ蛋白中，开发了一种基因编码的精氨酸（Arg）荧光探针。研究人员首先在纯化蛋白水平上筛选了cpEGFP的插入位点，并通过将探针与iSeroSnFR的膜靶向序列融合，筛选出两种响应较好的探针ArgS0.1和ArgS0.2。随后，团队进一步优化了连接肽邻近位点，最终筛选出响应值最佳的探针ArgS1。为了验证探针的特异性，研究人员将ArgS0.1、ArgS0.2和ArgS1在大肠杆菌中表达并纯化，测试了它们对精氨酸及其代谢物的响应。结果显示，ArgS1对精氨酸的特异性最强，并且其响应表现出对pH的依赖性；此外，ArgS1对精氨酸相关代谢物的响应极其微弱，这充分说明它在检测过程中受其他物质干扰的程度极小，具备较高的检测准确性和可靠性。
图1. ArgS传感器的体外测量
2、Arg传感器检测HEK293T细胞细胞质和亚细胞器中Arg的变化
研究团队在HEK293T细胞中表达了ArgS0.1、ArgS0.2和ArgS1三种探针，验证其在哺乳动物细胞中检测Arg的能力。三种探针均能响应Arg的增加，其中，ArgS1的动态范围最大（3.3）。进一步测量ArgS1在细胞内的结合亲和力，利用毛地黄皂苷透化细胞膜，并添加不同浓度的Arg进行原位滴定。结果显示，ArgS1在HEK293T细胞质中的Kd值为64μM。此外，非结合对照探针ArgS1-C对1 mM Arg无响应，排除了非特异性信号干扰。接下来，在HEK293T细胞中表达ArgS1，并使用精氨酸酶抑制剂（AI1）和一氧化氮合酶抑制剂（L-NMMA）调控Arg浓度，以研究药物干预对Arg水平的影响，发现AI1或AI1与L-NMMA联合应用可显著提高细胞内Arg水平，而单独使用L-NMMA无此效果。这表明在HEK293T细胞中，精氨酸酶途径在Arg降解中起主导作用，与转录组测序结果一致。研究团队进一步验证了探针在亚细胞器中的响应能力，将ArgS1和ArgS0.1分别靶向线粒体、内质网、溶酶体和细胞核。结果表明，ArgS探针能够有效监测哺乳动物细胞质和亚细胞器中的Arg动态变化。
图2. HEK293T细胞质中ArgS1传感器对Arg浓度变化的响应
3、细胞外Arg缺失引起癌症细胞内精氨酸水平降低
精氨酸饥饿疗法正被研究作为治疗ASS1缺陷型癌症的潜在策略。以乳腺癌细胞系MDA-MB-231为例，该细胞不表达ASS1。研究团队首先验证了Arg剥夺对细胞活力的影响，发现剥夺24小时后，MDA-MB-231细胞活力显著下降，而ASS1过表达可恢复细胞对Arg饥饿的耐受性。为实时监测细胞内Arg水平，团队构建了稳定表达ArgS1的MDA-MB-231细胞系。结果显示，Arg剥夺后，ArgS1的488/405比率及其衰减速率均显著降低，表明细胞内Arg水平下降。此外，ASS1过表达组的488/405比率高于ASS1缺陷组，证实ASS1过表达可恢复Arg水平。为进一步排除非特异性信号干扰，团队在MDA-MB-231细胞中表达了非结合对照探针ArgS1-C，其对1 mM Arg灌注无响应。这些结果表明，ArgS1探针能够有效监测癌细胞中的Arg水平变化。
图3. MDA-MB-231细胞中Arg的成像
02 结论
本研究成功开发了一种基因编码的精氨酸传感器ArgS1，具有高特异性、大动态范围和适用于生理浓度的特点。ArgS1能够在细胞质和亚细胞器中实时监测精氨酸浓度的变化，为精氨酸相关疾病的研究和治疗提供了重要工具，特别是在癌症治疗中，ArgS1可用于评估精氨酸饥饿疗法的效果，并筛选适合该疗法的患者。