淋巴细胞受体在有颌和无颌脊椎动物中独立进化，具有相似的适应性免疫反应。然而，与有颌动物相比，无颌脊椎动物淋巴细胞的功能亚型和分子结构的多样性尚未得到很好的界定。作者用scRNA-seq分析了七鳃鳗（Lampetra morii）的鳃、肠和血液，并使用全长转录组作为参考。研究结果显示，与B样细胞相比，T样细胞具有更高的组织特异性异质性。作者鉴定出一种独特的T样细胞亚型，表达非淋巴细胞造血生长因子受体的同源物MPL-L。这些MPL-L+ T样细胞表现出与下颚脊椎动物的T细胞不同的特征，特别是造血基因的表达升高。进一步发现MPL-L+VLRA+ T样细胞广泛存在于七鳃鳗的斑目鱼、鳃、肝脏、肾脏和皮肤中，它们在T细胞有丝分裂原和重组人血小板生成素的作用下增殖。这些发现为无颌脊椎动物的适应性免疫反应提供了新的见解，为适应性免疫的进化提供了新的思路。

scRNA-seq

1. L.Mori幼虫的多免疫组织细胞图谱

无颌和有颌脊椎动物的适应性免疫系统（AIS）由独特的淋巴样受体系统支撑。作者利用了L. morii的全长转录组进行进一步的单细胞RNA测序数据分析。结果证明了基因信息全长转录组提供的数据足以支持后续分析。

为了研究七鳃鳗免疫组织中细胞类型的多样性，从三种组织类型中采集了单细胞样本：鳃、血液和肠（包括肠系膜），并制备了六个鳃文库、三个血液文库和五个肠文库。保留了25,978个鳃细胞、16,483个血液细胞和23,204个肠细胞用于进一步分析，中位数分别为590、489和873。根据ALAS1和CD45，区分了红细胞和免疫细胞群体。根据VLRA、VLRC和VLRB基因的表达情况，进一步区分了T样细胞和B样细胞。首先注释了鳃的细胞图谱，重点是通过先前文献识别髓系细胞群体以及差异表达基因的分析。值得注意的是鉴定出一个特定的细胞群体，其特征是表达多种干扰素刺激基因（ISGs），包括MX1、TRIM25/29/80、TRIM65等。这种表达模式表明这些ISGs表达细胞对干扰素信号具有独特的反应。还鉴定出一个造血细胞群体（TAL1、ITGB3、PMP22等），上述标志基因也被用于后续肠道和血液图谱的注释过程。

2. 组织间的细胞异质性

为了更好地比较鳃、血液和肠道中细胞类型的差异，整合并聚类了这些细胞类型，包括红细胞、表达ISGs的细胞、造血细胞、内皮细胞、成纤维细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞/DC细胞、上皮细胞、T细胞和B细胞。红细胞和淋巴细胞的比例高于其他三种组织中的其他细胞类型。肠道中的先天免疫细胞浓度相对鳃和血液更高。使用抗VLRA pAb的免疫组化方法鉴定鳃丝和鳃片中的VLRA+细胞。结果显示，在所有研究的组织中均观察到大量棕色阳性信号。

进一步进行了MetaNeighbor分析，以探究三种组织之间的细胞类型关系。ISG表达细胞、造血细胞和红细胞在鳃和肠中表现出相似的特征，在这三种不同的组织中显示出相同的表达模式。在B细胞中观察到了显著的跨组织相似性，但在T细胞中未见此现象。B细胞的基因表达谱表现出显著的一致性。在所有三种组织中均存在。然而，某些T细胞标志物和差异表达基因的表达谱显示了显著异质性，这可归因于T细胞亚型的组织特异性分化。

3. 不同淋巴细胞亚型的发现和表征

重新整合并分析了T细胞和B细胞。根据差异基因表达谱，鉴定出五种T细胞亚型和一种B细胞群体。通过分析特征基因，发现大多数T细胞亚型高度表达了与传统T细胞功能相似的基因。MPL-L⁺T细胞的标志性基因与造血有关。MPL-L基因在MPL-L⁺T细胞中高度且广泛表达，并与VLRA共表达。有趣的是，MPL是颌类脊椎动物中的一种非淋巴系造血生长因子受体，主要与其配体血小板生成素（TPO）结合，参与造血干细胞（HSCs）的自我更新和巨核细胞衍生血小板的成熟，但不参与淋巴细胞的发育和激活。同时，MPL能够激活一系列信号传导途径，包括JAK/ STAT磷酸化途径和RAS途径。然而，目前的小鼠研究表明，通过转基因技术将MPL基因引入T细胞可以增强T细胞的自我更新能力和抗肿瘤能力，这基于TPO-MPL信号传导途径与T细胞激活过程中共刺激分子和细胞因子产生的共同信号通路重叠。基于观察到的转录异质性和独特的分布模式，作者认为MPL-L⁺T细胞构成了七鳃鳗淋巴细胞谱系中的一个非常规群体。

4. MPL-L⁺T细胞代表了无颌脊椎动物适应性免疫系统的一个独特方面，与有颌脊椎动物不同

SAMap分析结果显示，七鳃鳗与斑马鱼和小鼠之间在先天免疫细胞和造血细胞/造血干细胞/巨核细胞方面存在广泛的共识。B细胞与小鼠中的B细胞相似度较低，而斑马鱼中则表现出明显的B细胞一致性。在七鳃鳗T细胞谱系的跨物种映射中，结果显示出复杂的关系。作者分析了斑马鱼/小鼠和七鳃鳗中mpl/Mpl/MPL-L基因的分布和表达。结果显示，绝大多数MPL-L⁺ T样细胞和造血细胞在七鳃鳗中表达MPL-L基因，而在斑马鱼/小鼠中仅HSCs/巨核细胞表达该基因。

为了验证MPL-L⁺T样细胞是否仅存在于七鳃鳗中，作者对斑马鱼的多个器官（肝脏、头肾、胸腺和鳃）进行了原位杂交和共定位分析。结果显示，mpl并未与T细胞标志物lck共定。作者还制备了抗Lm-MPL-L多克隆抗体，并通过免疫荧光检测了七鳃鳗中MPL-L与VLRA之间的共定位。观察到MPL-L和VLRA在鳃丝、皮肤、肾脏和肝脏中共定位。基于这些结果，表明了七鳃鳗T细胞的潜在激活信号以及脊椎动物中淋巴细胞谱系的进化分化。

5. MPL-L⁺ VLRA⁺细胞对植物血凝素-L（Pha-L）和重组人TPO（rhTPO）的反应

为了进一步验证MPL-L⁺ VLRA⁺细胞是否具有T细胞抗原反应特征并对人TPO有响应，作者对尾蚴进行了腹腔注射PHA-L和rhTPO。免疫荧光检测结果显示，PHA-L和rhTPO的刺激导致VLRA和MPL-L共定位区域增加，并促进了MPL-L在肠系膜中的表达。结果还显示，注射后鳃丝中MPL-L⁺ VLRA⁺细胞的比例增加。然而未观察到鳃丝中MPL-L⁺ VLRA⁺细胞群体内MPL-L表达水平有显著变化。此外，用抗VLRA和抗MPL-L染色的细胞流式细胞术分析显示，rhTPO注射后MPL-L⁺ VLRA⁺细胞的比例增加。此外， PHA-L免疫刺激促进了VLRA⁺细胞和MPL⁺细胞的增殖。这种刺激可能促进分化过程早期或晚期阶段的细胞增殖，这些细胞分别表达MPL-L或VLRA。EdU注射也显示，在rhTPO注射后，鳃丝和鳃丝中细胞增殖增加。

6. MPL-L⁺T细胞的特征分子谱和发育轨迹

通过使用Monocle2推断状态轨迹，探索了T细胞亚群中的动态细胞转变。根据轨迹信息，确定这一轨迹始于T细胞亚型3，最终大多数MPL-L⁺T样细胞达到了与其他三个细胞亚群不同的终末状态。计算了每个T样细胞亚群中表达VLRA基因的细胞比例以及VLRA基因的平均表达量。观察到表达VLRA基因的T细胞亚型3的比例较为温和，且T细胞亚型3中VLRA基因的平均表达水平在所有T样细胞亚群中最低。T细胞亚型2中VLRA基因的表达水平略高于T细胞亚型3，而T细胞亚型1和MPL-L⁺T样细胞主要处于终末状态。

肠道、血液和鳃中的MPL-L⁺T样细胞群体通过差异表达基因得以区分。为了进一步确认MPL-L⁺T细胞在三种组织中的异质性，还利用Monocle 2轨迹分析来确定这些组织内MPL-L⁺T细胞的过渡状态。结果显示，这些细胞处于独特的分化状态。结合轨迹转换信息和表达VLRA基因的细胞比例，推断出MPL-L⁺T细胞在其各自组织中表现出转录和发育多样性。在鳃、血液和肠道中MPL-L⁺T细胞的转化过程中，形成了三种组织特异性基因表达模式。T细胞共刺激分子CD63和先天淋巴细胞谱系的标志性转录因子ZBTB16也在肠道中的MPL-L⁺T细胞中表达。

为了进一步研究MPL-L基因在不同组织中MPL-L⁺T细胞中的潜在作用及其调控机制，确定了三种MPL-L⁺T细胞亚群中表达MPL-L基因的细胞比例及该基因的平均表达水平，在三种组织中，MPL-L基因随着MPL-L⁺T细胞的发展轨迹呈现出显著上升的趋势。证实MPL-L基因的表达与其下游基因JAK2和STAT5B在MPL-L⁺T细胞中呈正相关。肠道MPL-L⁺T细胞中的正相关关系比其鳃和血液中的更为明显。这些发现表明，在MPL-L⁺T细胞内可能存在一个基于MPL-L的信号传导系统，可能协调肠道MPL-L⁺T细胞的发育或激活。

参考文献：

Huang Y, Liu X, Li S, Li C, Wang HY, Liu Q, Chen JY, Zhang Y, Li Y, Zhang X, Wang Q, Liu K, Liu YY, Pang Y, Liu S, Fan G, Shao C. Discovery of an unconventional lamprey lymphocyte lineage highlights divergent features in vertebrate adaptive immune system evolution. Nat Commun. 2024 Sep 3;15(1):7626. doi: 10.1038/s41467-024-51763-2. PMID: 39227584; PMCID: PMC11372201.